کشت بافت گیاهان زینتی(بخش سوم)

محیط های مورد استفاده در کشت بافت

محیط کشت گیاهی موراشیک و اسکوگ (۱۹۶۲)

تهیه محیط کشت MS با استفاده از محلول های مادری مواد شیمیایی که در آزمایشگاه تهیه شده اند، انجام می پذیرد. تهیه محیط کشت MS از مواد شیمیایی پایه وقت گیر و دشوار است ولی این مزیت را دارد که جهت تغییر اجزاء خاص محیط کشت انعطاف پذیری دارد و احتمالا ارزان تر تمام می شود. محیط کشت MS شامل سه دسته مواد اصلی است: مواد غذایی پرمصرف مواد غذایی کم مصرف و ویتامین ها.

محلول های عناصر ذخیره کم مصرف و پرمصرف در محیط کشت موراشیک و اسکوگ

برای تهیه محلول های عناصر ذخیره کم مصرف به مقدار نیمی از حجم نهایی در یک ارلن آب ریخته می شود و هر یک از نمک ها به دقت وزن شده در آب حل شدند و در فشار 1/2بار بر سانتی متر مربع و دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد استریل شدند و تا قبل از زمان مصرف در دمای ۴ درجه سانتی گراد نگهداری گردیدند. پس از حل شدن کامل آنها، محلول ها به حجم مورد نظر رسانده می شودند. و در مورد عناصر پر مصرف هنگام تهیه محیط کشت به صورت نمک به محیط کشت اضافه می شودند.

محلول ذخیره آهن

برای تهیه این محلول ذخیره مقادیر ذکر شده از سولفات آهن و سدیم اتیلن دی آمین تترا استیک اسید (جدول محلول ذخیره آهن و ویتامین ) به طور جداگانه وزن و هر یک در 40 میلی لیتر آب مقطر استریل ولرم حل می شودند پس از حل شدن کامل، محلول سدیم اتیلن آمین تترا استیک اسید به سولفات آهن اضافه می گردد و حجم محلول به 100 میلی لیتر رسانده می شود. این محلول در ظرف تیره در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری می شود.

محلول ذخیره ویتامین ها

هر یک از ویتامین ها به میزان ذکر شده وزن و داخل 50 میلی لیتر آب مقطر استریل حل می شوند. پس از حل شدن کامل حجم محلول به 100 میلی لیتر رسانده می شود. این محلول ذخیره در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری شد و پس از تهیه محیط کشت به مقدار لازم از این محلول ذخیره به محط ها اضافه شد.

محلول ذخیره هورمون ها

محلول ذخیرهD-4,2

50 میلی گرم از هورمون توفوردی وزن و در چند سی سی اتانل 96 درصد به طور کامل حل می شود و پس از آن با استفاده از آب مقطر استریل حجم آن به 100 میلی لیتر رسانده می شود. در هنگام تهیه محلول ذخیره-D 2,4 باید دقت شود که هورمون رسوب نکند، بدین منظور آب مقطر کم کم اضافه می شود. این هورمون بعد از اضافه شدن به محیط کشت و اندازه گیری pH همراه محیط کشت اتوکلاو شد.

محلول ذخیره هورمون بنزیل آمینو پورین (BAP)

این هورمون ابتدا در چند سی سی محلول یک نرمال سود به طور کامل حل میشوند و سپس به حجم مورد نظر رسانده می شوند. محلول های ذخیره هورمون ها تا زمان مصرف در 4 درجه سانتی گراد نگهداری می شوند. چنان چه محلول ذخیره هورمون ها تحت شرایط کاملا استریل تهیه و نگهداری شوند طول مدت نگهداری آنها افزایش می یابد و احتمال بروز آلودگی کاهش یابد. چون این هورمون در سود حل می شود باید بعد از اضافه نمودن این هورمون به محیط کشت pH را اندازه گیری نمود. این هورمون همراه محیط کشت اتوکلاو شود.

محلول ذخیره TDZ

مقدار 3 میلی گرم از هورمون را در یک سی سی حلال دی متیل سولفوکساید (DMSO) به طور کامل حل نموده و در ظرف تیره در دمای 4 درجه سانتی گراد نگهداری می شود. این هورمون در هنگام ریختن محیط کشت به وسیله فیلتر اضافه می شود.

تکنیک های تهیه و تولید کشت بافت قارچ ها

هوایی که از آن تنفس می کنیم مملو از موجودات بسیار ریز است که با باد به حرکت در می آیند. قارچ ها، باکتری ها، ویروس ها و گیاهان برای انتقال گرده های خود به مناطق دیگر از باد کمک می گیرند. در صورت عدم رعایت نکات بهداشتی، این ذرات می توانند چه در تهیه کشت خالص و چه در فرآیند تولید قارچ خوراکی خلل وارد نمایند. به طور کلی منابع اصلی آلاینده محیط کشت عبارتند از:

1. محیط اطراف
2. ظروف کشت
3. ادوات و ابزار کشت
4. پرورش دهنده و لباس وی
5. هاگ ها یا میسلیوم قارچ خوراکی

قارچ ها و تمامی موجودات زنده نسبت به مواد غذایی، رقابت تنگاتنگ و دائمی با یکدیگر دارند. هدف از ایجاد یک محیط استریل، حذف یا کاهش این گونه رقابت و در نهایت فراهم ساختن شرایط مناسب برای تکثیر قارچ خوراکی می باشد. اولین مرحله قبل از تهیه کشت خالص، احداث اتاقک تلقیح یا آزمایشگاه استریل است.

طراحی و احداث آزمایشگاه استریل

علت عمده شکست بیشتر پرورش دهندگان قارچ، عدم صرف وقت کافی به منظور احداث آزمایشگاه استریل است. کاری که چندان هم وقت و انرژی نمی برد، بلکه فقط یک و نیم روز کافی است تا یک انباری کوچک یا یک آبدارخانه را به یک اتاقک تلقیح مفید تبدیل نمود. برای شروع تمام قالیچه ها، پتوها، پرده ها و دیگر مواد پارچه ای را که پناهگاه خوبی برای گرد و غبار و هاگ های مضر می باشند از محل دور کرده و تمامی دیوارها و سقف را با یک ماده ضد عفونی کننده کاملا تمیز نمائید. اتاق را با یک رنگ روغنی براق یا اپوکسی بهداشتی رنگ زده تا شستسوهای بعدی راحت تر گردد. پنجره ها یا هر منبع ورودی هوا را با یک پوشش پلاستیکی مناسب بپوشانید. محل ورودی اتاق را با پلاستیک یا هر ماده دیگر به صورت یک محفظه انتظار در آورده تا مانع جریان مستقیم هوا به درون اتاق گردد و طراحی این محفظه باید به گونه ای باشد که هنگام ورود به آن، درب آزمایشگاه بسته باشد.

آزمایشگاه کشت بافت قارچ

آزمایشگاهی با محیطی نیمه استریل بسته به حجم استفاده و دفعات کاری ایجاد نمود. درصد پاکی لازم برای اتاق استریل تابع مقدار هاگ محیط بیرون است. به عنوان مثال، در فصل زمستان با سرد شدن هوا، مقدار هاگ و آلاینده های هوا تا حد زیادی کاهش یافته، حال آن که در طول تابستان و بهار این مقدار بسیار زیاد می باشد. بنابراین لازم است در طی این دو فصل توجه کافی به استریل بودن محیط آزمایشگاه مبذول گردد. نکته مهم دیگر این که، تمامی ظروف و بطری های شیشه ای آلوده را باید به طریقی از بین برد تا ضریب آلودگی محیط آزمایشگاه به حداقل برسد. بعد از احداث اتاق استریل باید یک سری اصول و نکات بهداشتی را کاملا رعایت نمود. به این صورت که اتاق استریل را باید با یک محلول سفید کننده (آب ژاول) کاملا تمیز نمود؛ کف را طی کشیده و در پایان هوای اتاق را با یک محلول سفید کننده 10 درصد و با استفاده از یک سم پاشی پشتی یا اسپری ضدعفونی نمائیم. حداقل تا 15 دقیقه بعد از محلول پاشی نباید وارد اتاق شد. در هر مرحله از تلقیح و کشت این عملیات باید تکرار شود، چون که همواره پیش گیری آسان تر و بهتر از درمان است.

میزان هاگ آلاینده درون آزمایشگاه

آماده کردن محیط کشت پس از تکمیل آزمایشگاه نوبت به تهیه محیط کشت مغذی آگار می رسد. آگار، محصولی است که از نوعی جلبک دریایی به دست آمده و برای سفت کردن محیط کشت به کار می رود و از نظر ظاهری بسیار شبیه ژلاتین است، اما از نظر کارکرد، به مراتب از آن سودمندتر است. در زمینه تولید محیط کشت آگار غنی شده که مناسب قارچ های خوراکی باشد، فرمول های متعددی وجود دارد که از این میان می توان به فرمول های استاندارد PDA و MEA همراه با مکمل خمیرمایه اشاره نمود. در بسیاری از مجلات قارچ شناسی، فهرستی از انواع محیط های کشت آگار حاوی پپتن و نئوپپتن (دو منبع سرشار از پروتئین مورد نیاز میسلیوم) ارائه شده است. محیط کشتی که توصیه می نمایند، مخلوطی از دانه های جوشانده شده گندم یا چاودار غنی شده با شیره مالت است. برای افزایش رشد می توان به محیط کشت زایلوز و1- آرابینوز (از قندهای پنج کربنه پنتوزی متبلور) اضافه کرد. از جمله مواد لازم دیگر برای محیط کشت می توان کلسیم، بیوتین، تیامین، اسیدهای آمینه اسپاراژین، آلانین و گلایزین را نام برد. سه نوع فرمول مغذی آگار تهیه شده است که هر کدام از آنها برای رشد میسلیوم های انواع مختلف قارچ خوراکی هم چون دکمه ای، صدفی، شی تاکه، استروفاریا، چینی، پانالوس و سیلوسب استفاده می شود که از بین آن ها در محیط PDY و MPG مورد توجه می باشند. توصیه می شود برای افزایش رشد میسلیوم ها به هر محیط، مقداری پودر چاودار و یا عصاره آن افزوده شود. بعد از انتخاب هر یک از فرمول های زیر ترکیبات آن را به صورت خشک با هم مخلوط کرده، درون یک فلاسک ریخته و در نهایت با افزودن آب، حجم مخلوط را به یک لیتر برسانید.

الف) آگار PDY (مخمر دكستروز سیب زمینی)

• عصاره صاف شده 300 گرم خلال سیب زمینی که در یک لیتر آب تا یک ساعت جوشیده باشد
• 10 گرم قند (گلوکز راست گرد) (قند دکستروز)
• 2 گرم مخمر (اختیاری)
• 20 گرم آگار

ب) آگار MPG (مخلوط بذر- پپتین – مالت)

• 20 گرم مالت عسلی رنگ
• 5 گرم پودر بذر چاودار
• 5 گرم پپتین یا نئوپپتن
• 2 گرم مخمر (اختیاری)
• 20 گرم آگار

ج) آگار MEA (آگار عصاره مالت)

• 20 گرم مالت عسلی رنگ
• 2 گرم مخمر
• 20 گرم آگار

نکات ضروری در تهیه محیط کشت

در تهیه محیط کشت، رعایت نکات زیر ضروری است:

 1- pHمحیط کشت

گونه های متفاوت قارچ برای رشد و نمو در محیط کشت،PHخاص خود را می طلبند. به طوری که پی اچ مطلوب برای گونه های سیلوب 7-6 می باشد، در حالی که این مقدار برای نوع دکمه ای7-5/6می باشد. اکثر گونه ها، نسبتا مقاوم بوده و به خوبی در دامنه 7/5-5/5 رشد می نمایند.پی اچ کمتر از 4/5 و بالاتر از 7 باعث توقف رشد و نمو (هاگ ها و میسلیوم ها) می گردد و چنان چه پی اچ محیط خیلی پائین باشد.محیط کشت رقیق می شود و باید محیط تازه با پی اچ مطلوب آماده شود. پی اچ، بعد از اتوکلاو کردن تا 0/4 واحد کاهش می یابد. چنان چه در حین تهیه محیط کشت،پی اچ خیلی پائین یا بالا رود، می توان به ترتیب آن را باNaoH یا Hcl تا 0/1 مولار رقیق، تعدیل کرده سپس محیط کشت را کاملا هم زده و سپس پی اچ آن را با یک پی اچ سنج یا کاغذ تورنسل معمولی می سنجیم.

2.ضد عفونی محیط کشت

این کار معمولا به دو روش صورت می گیرد.

الف: با مواد شیمیائی: مانند الكل 70درصد؛ هیپوکلریت سدیم (وایتکس) ۱ درصد و بالاخص آنتی بیوتیک ها۔ در هر صورت ساده ترین راه، استفاده از مواد گیاهی غیر آلوده است. جهت کنترل باکتری ها در محیط کشت، 0/1 گرم از محلول سولفات جنتامایسین 80-60 درصد را قبل از عمل اتوکلاو کردن باید به هر لیتر از این محیط ها اضافه نمود. هم چنین می توان از نوع دیگر آنتی بیوتیک بنام استرپتومایسین بعد از استریل کردن محیط کشت استفاده کرد. در مجموع باید از آنتی بیوتیک ها به صورت موقتی و به مقدار بسیار اندک بهره جست چون غلظت بالای آنها، مانع رشد و نمو بعضی گونه ها و از طرف دیگر ایجاد مقاومت در باکتری ها می شود.

ب) با بخار: بعد از اختلاط کامل ترکیبات محیط کشت و در صورت باقی ماندن اثرات باکتری بعد از ضد عفونی شیمیائی (آنتی بیوتیک ها) می توان برای رفع هر گونه آلودگی با بخار تحت فشار، محیط کشت را استریل و یا به اصطلاح اتوکلاو نمود. استریل کردن صحیح، بستگی به زمان، فشار، درجه حرارت و حجم ماده مورد استریل دارد. در شرایط عادی می توان محیط کشت آماده را داخل ارلن پیرکس (به علت دهانه تنگ آن میزان تهویه، خشک شدن و ضریب آلودگی کاهش می یابد) ریخته درب آن را با یک فویل آلومینیومی پوشاند. دقت کنید که حجم آگار درون ارلن نباید از تا حجم كل ظرف بیشتر شود. ظرف کشت را داخل اتوکلاو یا زودپز معمولی قرار داده وته زودپز را یک سانتی متر آب مقطر بریزید تا بخار لازم تأمین شود. طبق دستورالعمل شرکت سازنده، درب زودپز را کاملا بسته آن را حرارت دهید تا بخار فراوان تولید نماید. قبل از بستن سوپاپ اطمینان بخار، بگذارید تا بخار آن به مدت 4 تا 5 دقیقه خارج شود. به آرامی فشار را به 15 پوند رسانده و 30 دقیقه در همین فشار نگه دارید. توجه کنید دمای ظرف از 121 درجه سانتی گراد فراتر نرود، چه در غیر این صورت قند موجود در محیط کشت، سوخته و به اصطلاح کارامل می شود که در نتیجه آن؛ رشد میسلیوم متوقف شده، یک سری جهش های ناخواسته ژنتیکی پدیدار می شود. از طرفی اتوکلاو کردن بیش از 30 دقیقه باعث ته نشین شدن املاح مفید و تجزیه آگار می شود. هم چنین باید ظروف خالی شیشه ای و کاغذها را به طور جداگانه به مدت 30 دقیقه در دمای 130 درجه سانتی گراد (به صورت خشک) استریل نمود. نکته حائز اهمیت دیگر در مورد اتوکلاو کردن، این که زمان لازم برای این عمل بسته به ارتفاع از سطح دریا، متفاوت است. طبق قانون بویل – ماريوت؛ در حجم ثابت، دما و فشار رابطه مستقیمی با یکدیگر دارند. فشار هوا را معمولا نسبت به سطح استاندارد دریا محاسبه نموده و هر چه از سطح دریا بالاتر می رویم فشار هوا کمتر می شود. لذا در ارتفاعات بالاتر، متناسب با مقدار ارتفاع از سطح دریا، باید فشار اتوکلاو یا زودپز را افزایش دهیم تا خللی در عمل استریلیزاسیون وارد نشود. ذیلا نسبت های بین پارامترهای دما، فشار هوا و تغییرات نقطه جوش آب در ارتفاعات مختلف را در جدول ذیل می بینید. به عنوان مثال در ارتفاع حدودا 1500 متری از سطح دریا، نقطه جوش آب نسبت به سطح دریا تقريبا 4/5 تا 5 درجه سانتی گراد کاهش می یابد (95 درجه سانتی گراد) و از طرفی در این ارتفاع؛ فشار هوا 5 پوند یا تقريبا 0/4 اتمسفر نسبت به سطح دریا افزایش می یابد (1/4 اتمسفر) در نتیجه با توجه با این که نباید دمای داخل اتوکلاو را (به سبب بروز تغییرات شیمیائی مواد داخل آن) افزایش دهیم، به ناچار مجبوریم، فشار را به میزان 0/4 آتمسفر (5 پوند) بالا ببریم تا جبران 5 اختلاف دما را در این ارتفاع با توجه به حجم ثابت مواد درون اتوکلاو بنماید. توجه کنید استریلیزاسیون در فشار 1/05 kg/cm به مدت یک ساعت دارای نتایج مشابهی با استریلیزاسیون در فشار ۲kg/cm2 به مدت 30 دقیقه (یعنی دو برابر کردن فشار و نصف کردن مدت زمان)  دارد، منتها مسأله مهم در این جا این است که اکثر زودپزها تحمل این فشار را ندارند که باید حتما قبل از استفاده به بر چسب کنترل کیفی روی هر زودپز توجه شود. بعد از اتمام استریل کردن؛ زودپز را در آزمایشگاه یا یک اتاق نیمه استریل قرار داده، اجازه دهید تا قبل از باز کردن درب آن، فشار به یک پوند(kg/cm 0/07)کاهش یابد. سپس درب آن را باز نمائید و اقدام به ریختن آگار در پتری دیش ها نمائید. باید دانست با هر لیتر از محلول آثار به دست آمده می توان 30 پتری دیش 15*100 میلی متر را پر نمود. چنان چه با محدودیت فضای میز کار مواجه هستید، می توانید پتری دیش ها را پس از پر نمودن یک به یک روی هم بگذارید اما در غیر این صورت می توانید هر یک از پتری دیش ها را در کنار هم قرار دهید و دامنه کار خود را توسعه دهید. پیش از پر نمودن پتری دیش ها، محلول کشت را به شدت تکان دهید تا محتویات آن خوب پخش شده مخلوطی همگن به دست آید. سپس بگذارید تا آگار خنک شده و یکنواخت گردد و سپس اقدام به پر نمودن پتری دیش ها نمائید تا بدین وسیله از تعریق جدار داخلی ظروف که از ریختن محلول آگار گرم ناشی می شود، جلوگیری شود. حال، این محلول آماده کشت هاگ یا بافت زنده می باشد که در ادامه روش آن را خواهیم دید. کشت هاگ کشت خالص به منظور تهیه اسپان مورد نیاز برای تکثیر قارچ خوراکی را به دو روش می توان تهیه نمود. کشت هاگ، که به نوعی می توان آن را تکثیر جنسی نامید و دارای تفرق صفات و تنوع بالای نتاج حاصله از نظر کیفیت و کمیت محصول می باشد. از این روش بیشتر برای تهیه بذر قارچ استفاده می شود.

روش دوم کشت بافت زنده یا به اصطلاح تکثیر غیر جنسی و یا کلونینگ می باشد. این روش به علت شباهت بالای نتاج تولیدی با والدین؛ بیشتر در تکثیر قارچ هائی که از نظر کیفیت و کمیت محصول در حد مطلوبی هستند استفاده می شود. پرورش دهندگان قارچ، کشت هاگ را به دلیل راحتی اجرا و ماندگاری بالای هاگ ها حتى تا ماه ها بعد از تجزیه کلاهک ها ترجیح می دهند. اما ماندگاری کلاهک ها یا بافت زنده بسیار کم است (1 تا 2روز) و باید بلافاصله بعد از چیدن بافت، اقدام به کشت نمود. گرفتن نقش های مرحله اول در کشت هاگ جمع آوری مقداری هاگ (نقش اسپور) از قارچ های سالم و مناسب می باشد. بدین منظور کلاهک سالم، تازه و کاملا تمیزی را از ساقه جدا نموده و به طور واژگون روی یک کاغذ سفید یا سطح شیشه ای تمیز (اسلاید میکروسکوپ) یک تا دو ساعت می گذاریم. چنان چه کلاهک مورد نظر خشک باشد، جهت رهاسازی آسان تر هاگ یکی دو قطره آب مقطر به آن زده و برای جلوگیری از کاهش تبخیر و جریان هوای مستقیم، یک بشر بر روی آن می گذاریم. پس از چند ساعت که هاگ ها، کاملا رها شد و نقش تیغه ها روی کاغذ افتاد؛ کاغذ هاگ ها را بریده از وسط تا می زنیم و در یک ظرف کاملا در بسته گذاشته و روی آن را بر چسبی حاوی زمان جمع آوری؛ گونه قارچ و شماره جمع آوری می زنیم. در صورت جمع آوری هاگ ها روی لامل میکروسکوپ، کافیست هاگ ها را مابین دو لامل قرار داده دور تا دور لبه این دو لامل را با نوار چسب بچسبانیم تا از نفوذ هاگ های آلاینده، ایمن شود. در صورتی که در جمع آوری و نگهداری هاگ ها دقت کافی نشود، محيط کشت هاگ آلوده شده و امکان به دست آوردن یک کشت خالص کاهش می یابد.

کشت بافت در آشپزخانه منزل

تکثیر سریع تر (حدودا 10 برابر)، عاری از قارچ و دیگر میکروارگانیسم ها، نگهداری بیشتر گیاهان و ایجاد کلون های یکنواخت از محصولات باغی از مزایای کشت بافت می باشد.

اجزای محیط کشت

اکسیژن، هیدروژن و کربن (C, H, O) آلى.

ساکارز: تأمین کننده انرژی سلول ها.

اینوسیتول: یک قند ساده.

هورمون ها: کنترل کننده رشد گیاهی

قارچ کش ها: مواد کنترل کننده.

آنتی بیوتیک ها: مواد کنترل کننده.

آنتی اکسیدان ها و حاوی عناصر کم مصرف مانند آهن، روی و غیره و پر مصرف مانند نیتروژن، فسفر و پتاسیم می باشند. استفاده از شیشه غذای بچه، برای اتاقک رشد. شیشه غذای بچه (یا هر شیشه دهان گشادی) یک اتاقک رشد مناسب و ارزان می باشد. افراد مبتدی بهتر است، یک سوراخ در درپوش آن ایجاد کنند. برای جلوگیری از ورود آلودگی بهتر است درپوش را با یک ورقه آلومینیومی پوشانده شود، این کار موجب می شود محیط کشت، تنفس ناچیزی داشته باشد و محیط کشت از باکتری ها و اسپورها در امان می ماند. کشت بافت به فن آوری و تکنولوژی بسیار بالا، نیازی ندارد. تعداد بسیار زیادی از گیاهان را می توان به راحتی در آشپزخانه رویاند و رشد داد. دستورالعمل زیر برای گیاه حشره خوار می باشد. البته همین دستورالعمل را با آزمایش و خطا می توان برای دیگر گیاهان نیز به کار برد.

مواد لازم:

• شکر (یا قند) یک هشتم (1/8) فنجان.
• آب یک فنجان.
• محلول غلیظ (استوک) نصف فنجان.
• قرص اینوزیتول نصف (125 میلی گرم).
• قرص ویتامین (1/4) همراه تیامین.
• پودر آگار 2 قاشق سوپ خوری

جهت تنوع، سعی کنید شیره آناناس جایگزین بعضی از مواد فوق کنید. به طور معمول 100 تا 200 میلی لیتر از شیره آناناس در هر لیتر محیط کشت اضافه می کنند. اینوزیتول یک مکمل غذای مشهور است که به راحتی در سوپرمارکت ها یافت می شود. آگار نیز به راحتی در دسترس میباشد و در کشورهای آسیایی برای تهیه ماده ژل مانند جهت مصرف دسر، استفاده می شود. شما سعی کنید آگاری با رنگ سفید، خالص و بو نگرفته پیدا کنید.

ترکیب و توزیع مواد

از هر فرمول و ترکیبی که استفاده نمایید، شما بایستی مـواد را طبق دستورالعمل ترکیب کنید. معمولاً آب را قبل از اضافه نمودن آگار به آن بجوشانید. بعد از حل شدن کامل آگار، می توان 1 تا1/5سانتی متر از هر شیشه را با محیط کشت، پر نماید. مواظب باشید ماده کشت به لبه و اطراف شیشه نچسبد که بعداً منبع آلودگی می شود. جهت ضدعفونی کردن شیشه ها و دهانه های آنها را درون زودپز قرار دهید.

ضد عفونی ظروف و محیط کشت

مطمئن شوید درب زودپز کاملا بسته باشد. توجه کنید شما می خواهید با بخار مواد را ضدعفونی کنید و نمی خواهید آنها را بجوشانید. اگر چه می توان جهت ضدعفونی کردن مواد از میکروویو استفاده نمود، اما نتایج چندان قابل اطمینان نمی باشد. با یک زودپز خانگی، می توان از ضدعفونی شـدن محیط کشت مطمئن شد. بعد از این، توجه خود را به کاهش آلودگی طی کاشت بذور، معطوف کنید. از هر نوع زودپزی که استفاده می کنید، به مدت 15 تا 20 دقیقه با فشار 15 پاسکال / 250 فارنهایت (F 250 / PSI )مواد را ضدعفونی کنید. زمانی که دمای زودپز به دمای اتاق نزدیک شد، درب آن را باز کنید. بهتر است یک شب زودپز را به حالت در بسته نگه داری کرد و سپس درب آن را گشود. که علاوه بر ایمنی، این مزیت را دارد که آگار کاملاً ژله ای می شود و مشکل باقی ماندن محیط کشت در اطراف ظروف نیز وجود ندارد. بعد از سرد شدن کامـل مـواد، شما می توانید زودپز را باز کنید. ممکن است در این زمان زودپز یک حالت مکش پیدا کند و آلودگی وارد وسایل و مواد شود. به همین خاطر، پیشنهاد می شود شیر اطمینان زودپز با یک حوله نازک آغشته به الکل پوشانده شود.

ضدعفونی بذور یا بافت ها

• الكل معمولی یا ایزو پروفیل
• کلرین
• H2O2 (پری اکسید هیدروژن)
• محلول شستشو

می توان بذور را در یک پاکتی که از کاغذ صافی می سازیم، قرار داده، ۵ دقیقه در الکل نگهداری کنیم. 2 تا 4 دقیقه در محلول 1 به 10 کلرین انباشته شوند و نهایتاً 1 تا 2 دقیقه با محلول 3 درصد H2O2 شسته شوند. بذور را در فلاکس های جداگانه بکارید. که این کار اجازه می دهد شما روش ها و فرمول های خود را بهینه کنید.

انجام عمل تلقیح

در یک هود لامینار، جریان هوا با یک فیلتر هوایی بسیار قوی، فیلتر شده و بـه صـورت آرام و ملایم به طرف داخل وزیده می شود. اما برای اهداف کوچک یک سیستم بسیار ساده تر که این یک حالت خاصی از اتاقک انتقال می باشد و یک آکواریوم 40 گالنی است که اطراف آن با پوشش پلاستیکی پوشانده شـده است. در قسمت بالای آن یک لامپ فلورسنت تعبیه شده است. و دست های خود را با آب و صابون بشویید و با الكل ضدعفونی کنید.

یک ساعت خوب برای نمایش زمان ضدعفونی نمودن، مفید است. وسیله دیگر یک جفت انبرک یا قیچی می باشد. توجه کنید این ابزار باید به اندازه کافی طویل باشند تا کار با آنها راحت باشـد. یک تیغ تیز یا یک چاقوی تیز از موارد مورد نیاز است. یک چراغ الکلی یا حداقل یک شمع جهت ضدعفونی ابزار آلات طی مراحـل مختلف مورد نیاز است. می توان وسایل را در الکل نگه داشت و موقع استفاده با شعله، ضدعفونی کرد. با کشت بذور بیشتر، موفقیت شما در جوانه زنی بذور بیشتر می شود، اما آلودگی هم زیاد می شود.

انتقال گیاهان به مرحله رشد بعدی

می توان محیط کشت ها را در دمای خنک خانه (60 تا 75 درجه فارنهایت) با فاصله 12 اینچی از دو لامپ 40 واتی فلورسنتی، نگهداری کرد. همچنین، می توان ظروف شیشه ای را در یک آکواریوم مانند مرحله قبل نگهداری کرد. بعد از این که گیاهان کوچک شما به اندازه یک نخـود شـدند، شما می توانید جهت تکثیر آن ها را به شرایط درون شیشه انتقال دهید و یا این گیاهان را به خاک انتقال دهید. جهت تکثیر، بایستی با روشی ساده گیاه خود را برش دهید و به محیط کشت جدید انتقال دهید. همان طور که قبلاً مكرر ذکر شده است، شما باید در محیط ضدعفونی شده کار کنید که یک هود این کار را انجام می دهد. البته اگر شما ورزیده، ماهر و سریع باشید، با حداقل امکانات، مراحل فوق قابل انجام است.

انتقال گیاهان به خاک

نکته کلیدی موفقیت در انتقال گیاهان از محیط کشت به خاک، شستشوی کامـل ریشه ها و جدا کردن مواد محیط کشت از آن ها می باشد. می توان با قرار دادن گیاهان در مسیر آب، با کمک جریان آب، مواد زائد را از ریشه ها زدود. بعد از کاشت گیاهان در خاک باید شرایط قبل را برای آنها فراهم نمـود. توجه به رطوبت کافی، به سازگار شدن گیاهان کمک می کند.

اقلام مورد نیاز برای کشت بافت خانگی

1. یک جعبه ی سترون با هوای راکد، جهت انتقال گیاهان به کار می رود. یک حوض ماهی در یک سوی آن، جعبه ی انتقالی ایده آلی را به وجود می آورد. هر پلاستیک یا محفظه ی شیشه ای، با اندازه های 50 سانتی متـر(طول)، 40 سانتی متر (ارتفاع)، 40 سانتی متر (عمق)، به راحتی می تواند داخل جعبه ی انتقالی ایجاد شوند.
2. دیگ زودپزی برای ضدعفونی کردن واسطه ها، ادوات، آب، دستمال کاغذی و غیره.
3. قالب های شیشه ای (قالب های غذای کودک عالی می باشند) و ظروف خوراکی دور ریخته، با سرپوش هایی که نسبت به گرما، درون دیگ های زودپز مقاوم می باشند، ظروف ایده آلی جهت استفاده می باشند.
4. اسکالپل و پنس.
5. دستمال کاغذی یا حتی کاغذ نسخه ی سفید، با اندازه های تقلیل یافته، می توانند ضدعفونی (سترون) شوند، و برای سطح برش سترونی مورد استفاده قرار گیرند.
6. یک چراغ الکلی دارای الکل اتیلیک(اتانول)، جهت شعله ور کردن ادوات (از به کارگیری الکـل متیلیک (متانول)، بپرهیزید زیرا که آن سمی می باشد).
7. شیشه ی (بطری) افشانک دستی، شامل 70 درصد محلول الکل می باشد تا سوخت گاه (محفظه) انتقال، و سطوح دیگری می باشد تا اسپری پاشی کنند.
8. محلول کلر رقیق، 1/4رقت سفید کننده های خانگی برای سترون مواد گیاهی.
9. هر نوع ضد عفونی کننده ی پوست.
10. واسطه ها.

همه ی عناصری که در زیر ارائه شده اند، می توانند از سوپر مارکت هـا، داروخانه ها و فروشگاه هـای لـوازم بهداشتی، خریداری شوند.

1. دو فنجان آب باران.
2. یک چهارم فنجان شکر.
3. کود شیمیایی قابل حل در آب در ۱ لیتر از آب (مایه ی کود شیمیایی 1/2 قاشق سوپخوری همـه منظـوره (۱۰:۱۰:۱۰) .N.P.K). یک فنجان از مایه را برای این دستورالعمل به کار ببرید.
4. قرص اینوزیتول 1/2 قرص 4mg.
5. قرص ویتامین با تیامین: 1/2 قرص. هر نوع قرص مولتی ویتامینی می تواند استفاده شود.
6. پولک های (فلس ها) آگار: 4 قاشق سوپ خوری

این واسطه ی بنیادی (اساسی) می باشد.

برای آزمایش تکثیر و ریشه دهی (شیار زنی)

واسطه، 1/2 فنجان شیر نارگیل و 1/2 قاشق سوپ خوری مالت می افزاید.

شیر نارگیل را با 1/2 فنجان پوره ی گوجه فرنگی سبز یا 1/2 فنجان آب میوه ی تر و تازه جایگزین کنید. آب پرتقال می تواند واکنش های متفاوتی را ایجاد کند. از این اطمینان حاصل کنید که pH محیط کشت همیشـه بـين 5 و 6 باشد، تا pH با میزان محدودی را که شاخص اندازه ی pH با میزان وزن خالص باشد را اگر لازم باشـد با اسید، برای مثال اسید سیتریک یا با باز، برای مثال بی کربنات سدیم، به کار برد.

عناصر را در روغن دان (ماهی تابه) ترکیب کنید، و به آرامی بجوشانید تا زمانی که آگار حل شده باشـد؛ مرتباً آنها را به هم بزنید تا از چسبیدن آگار جلوگیری به عمل آورید و متعاقبا زیر ماهیتابه را به اشتعال در آورید. برای پخش کردن آنها داخل قالب های شیشه ای، از یک ملاقه (چمچه) استفاده کنید تا این که محیط کشت حدود 2 سانتی متر عمق پیدا کند. در یک دیگ زودپزی اختفا کنید و پرورش دهید. به مدت 15 دقیقه پس از این که فشاری حاصل شد، بپزید. (این زمانی حاصل خواهد شد که دریچه ی فشار اجازه ی بیرون آمدن بخار را می دهد).

ضدعفونی کردن ادوات و اقلام دیگر

پنس و اسکالپل می توانند با شستشو در محلول کلر یا با فرو بردن در الکل یا شعله، ضدعفونی شوند. آب سترون (ضد عفونی شده) برای آب کشی مـواد گیاهی و دستمال کاغذی سترون به عنوان یک سطح پاکی که بشود روی آن کار کرد، مورد نیاز می باشند. کارهایی که با دست انجـام می شوند، می توانند روی کاغذ انجام شوند. زمانی که عملیات تمام شد، دستمال کاغذی را می شود به دور انداخت، و یک سطح سترون تازه ای را از فرآورده های سفرون بر می گزینیم. آب را می توان در قالب های شیشه ای سترون کرد. کاغذها را در کیسه های کاغذی قرار دهید و آنها را در دیگ زودپز، روی سطوح آبی بپزید. کیسه، در اتمام عملیات ضدعفونی، مرطوب خواهد شد.کیسه را به یک دستگاه گرماسازی در 80 درجه ی سانتی گراد منتقل کنید، و به کیسه این امکان را بدهید که داخل کوره خشک شود. کاغذها را تا زمانی که مورد نیاز نباشد، باز نکنید.

ضد عفونی کردن مواد (اجسام) گیاهی

همه ی مواد گیاهی می توانند در سفید کننده های رقیـق خـانگی ضدعفونی شوند، برای مثال: White King(1/4 فنجانWhite King +سه چهارم فنجان آب + یک قطره پاک کننده ؛ پاک کننده ای که همچون سورفاکتانت عمل کند). تکه های گیاهی را در قالب هایی که سفید کننده ها را به مدت ۱۲-۱۰ دقیقه در بر دارند. بارها آنها را به هم بزنید. محلول کلر را به دور بریزید، این عمل باکتری و قارچ و گاهی اوقات برخی اجزای گیاه همچون پولک های بیرونی و پاجوش های نرم را از بین خواهـد بـرد. تکـه هـای گیاهی را دو مرتبه با آب سترون شستشو دهید.

عملیات در جعبه های سترون

محافظت بیشتری باید انجام شود تا اطمینان حاصل کنید که کشـت شـما عاری از هر گونه آلودگی (ناخالصی) می باشد. برای دست یابی به این، شرح ذیل را انجام دهید:

1. موهای خودتان را به پشت سرتان گره بزنید، آستین های خود را بالا بزنید و ساعت و هر چیز ارزش منـد دیگر را بردارید. (باز کنید). دستهای خود را کاملا با محلول ضدعفونی که مناسـب بـرای استعمال با پوست می باشد، شستشو دهید. اگر به هر ضدعفونی کننده ای حساسیت دارید، دست های خودتان را با آب بشویید و یک دستکش جراحی به دست کنید.
2. درون جعبه را با افشاندن 70 درصد  الکل و با خشک کردن توسط پارچه ی سترونی، ضد عفونی کنید.
3. کلیه ی اقلامی را که شما در نزدیکی یا درون جعبه نیاز خواهید داشت را جمع آوری و مرتب کنید.
4. در داخل کابینت عمل کنید و یک تکه ی ضدعفونی شده ای از ساقه را از قالب، با یک جفت پنس بردارید (مواد گیاهی را با دستتان لمس نکنید). ادوات خودتان را هم چنین با فرو بردن آن ها در الکل، بین هر دست کاری و مشتعل کردن آنها ضدعفونی (سترون) کنید. تکه های کوچک، دارای 2-3 سانتی متر طول، و بـرگ هـای اندک، می توانند برش یابند، و به محیط کشت آگار منتقل شوند. اگر برگ ها خیلی بزرگ بودند، آنها را نیز در اندازه های 1/2-1/3 برچینید یا ببرید.

یک قطعه (تکه) از پاجوش را داخل ظرف کشتی قرار دهید (مهم است که در این مرحله تنها یک پاجوش در هر ظرف کشت داشته باشیم، برای این که اگر پاجوشی آلوده شد، نتواند به پاجوش های دیگر پخش شود). دریچه های ظروف کشت را ببندید. قالب ها را در دمای اتاق دور از نور مستقیم خورشید نگه دارید.

تکثیر شاخه

شاخه ها ممکن است در مرحله قبلی دراز شده باشند پس از گذشت 4 هفته، آنها نیاز دارند به آماده سازی که انتقال یابند به محیط کشت که حاوی شیر نارگیل برای تکثیر بیشتر است. تکرار و استریل کردن محیط کشت، ابزارها و اتاقک. شما نیز باید از قبل دست هایتان را استریل کرده باشید. انتقال ظرف های حاوی شاخه ها به یک طرف کابینت و محیط کشت استریل شده به طرف دیگران استفاده کردن از پارچه های کاغذی، پنس و چاقوهایی که قبلا استریل شده اند. با یک جفت پنس، ساقه ها را از ظرف هایشان برداشته و آنها را در سطح پارچه کاغذی استریل شده که مرطوب است قرار دهید.

این نکته مهم است که همیشه پارچه های کاغذی را مرطوب نگه دارید تا اینکه گیاهان همیشه لطيف و می توانند به زودی خشک شوند. شاخه های جدا شده می توانند به شیشه های جدیدی انتقال یابند. در این مرحله حداکثر 5 تکه از گیاهان ممکن است در درون هر ظرف قرار داده شود. نگهداری کشت هایی که در مرحلـه قبـل توسعه یافته اند. مرحله تکثیر ممکن است تکرار شود. هر 4 هفته تا زمانی که گیاهان کافی به دست آمده باشد. به طور کلی شاخه ها می توانند تکثیر شوند 4-3 دفعه از هر 4 هفته. برای جلوگیری از آلودگی در طی این مرحله شما می توانید هوای آلوده را بگیرید؛ زیرا این هوا باعث کاهش بهداشت می شود.

تشکیل ریشه

زمانی که شما شاخه ها را به اندازه کافی ثابت کردید. شما می توانید اجازه رشد دهید به آنها قبل از آن که مراحل ریشه دهی شروع شود. شاخه ها به خاطر ریشه دهی به محیط کشتی که حاوی شیر نارگیل و جوانه جو است انتقال می یابند. حداکثر 5 شاخه در هر ظرف کشت قرار داده می شود. ظرف ها در جایی که قبلا نگه داری می شدند قرار می گیرند. ریشه ها بایستی در عرض 2 تا 4 هفته تشکیل شوند.

انتقال به آمیخته گلدانی

عمل مهم در این مرحله انتقال گیاهان به فضای آزاد است. گیاهان ریشه دار شده به صورت زیر نگهداری شوند:

• پر کردن گلدان ها با آمیخته گلدانی مناسب بدون هیچ حاصل خیزی و آب کافی و ثابـت کـردن میـزان آبیاری
• انتقال گیاهان ریشه دار شده از محیط کشت آگار با استفاده از یک جفت پنس
• شستشوی آگارها با آب ولرم به علت وجود ریشه ها
• ایجاد حفره در محیط کشت آمیخته خاکی و قرار دادن ریشه ها در داخل حفره ها به آرامی
• اسپری کردن شاخ و برگ با استفاده از اسپری دستی حاوی آب، این گلدان ها می توانند در داخـل ظـروف پلاستیکی بزرگتر با یک پوشش شیشه ای و دور از نور مستقیم آفتاب نگهداری شوند. زمانی که ریشه ها به اندازه کافی ثابت شدند و سازگاری یافتند. آنها می توانند حاصل خیز شده و پرورش یابند ماننـد سـایر درختـان افـزایش تدریجی نور نیز برای گیاهان لازم است