کشت بافت گیاهان زینتی (بخش دوم)

فرایندهای ریز ازدیادی

مراحل مختلف ریز ازدیادی به پنج مرحله زیر تقسیم می شود:

مرحله صفر: مرحله قبل از ازدیاد یا مرحله انتخاب و پیش تیمار گیاهان مناسب.

مرحله اول: آغاز رشد ریز نمونه ها، ضدعفونی سطوح، رشد ریز نمونه های مادر.

مرحله دوم:کشتریز نمونه ها و تکثیر آن ها.

مرحله سوم: شاخه زایی و ریشه زایی ریزگیاه ها.

مرحله چهارم: مقاوم سازی و جابه جایی.

معمولا مراحل فوق در سطوح تجاری برای تکثیر گیاهان مختلف استفاده می شود. واریته های گوناگون به تغییرات متنوعی برای رشد، مقاوم سازی و انتقال نیاز دارند. تکثیر و رشد گونه ای گیاهی در شرایط مانند شرایط طبیعی یا نزدیک به آن نقش بسیار مهمی در موفقیت کشت بافت دارد. به عنوان مثال، اگر یک واریته گل داوودی در شرایط طول روز بلند به کار می رود، بهتر است مراحل ۳ و ۴ در شرایط روز بلند انجام شود.

مرحله پیش تکثیر

در مرحله پیش تکثیر یا مرحله صفر بهتر است، گیاهان مادری در گلخانه و در شرایط عاری از بیماری، آفت و گرد و غبار نگه داری شوند. همه گیاهان مادری بایستی با قارچ کش ها و آفت کش های مناسب تیمار شوند تا آلودگی به حداقل برسد. کنترل آلودگی با پیش تیمار گیاهان دهنده شروع می شود که باعث افزایش رشد و نرخ تکثیر در کشت درون شیشه میشود. ریز نمونه های گیاهی بعد از استریل کردن، با روش های استاندارد کاشته می شوند.

مرحله I

در این مرحله، ریز گیاه های گرفته شده از گیاه مادری در شرایط کاملا استریل ضدعفونی می شوند. شرایط استریل و ضد عفونی در این مرحله و در کل مراحل ریز ازدیادی بسیار مهم می باشد. به طوری که در اکثر مواقع، عدم موفقیت در کشت بافت به دلیل آلودگی می باشد تا عدم تأمین مواد مورد نیاز، ریز گیاه ها به محیط درون شیشه منتقل می شوند. در این پروسه نیز باید قسمت های کوچک گیاهی با مواد شیمیایی مانند هیبوکلراید سديم، الكل اتیلن و مواد شوینده همراه آب دو بار مقطر، قبل و بعد از تیمار با مواد شیمیایی، تیمار شوند. بعد از یک دوره کوتاه کشت، معمولا ۳ تا ۵ روز، ریز گیاه های آلوده، دور انداخته می شوند. ریز گیاه هایی که زنده مانده و رشد کرده اند، برای زیر کشت های بعدی، نگه داری می شوند.

روش ضد عفونی نمودن گیاه

در این روش، ریز گیاه با آب مقطر شسته می شوند. سپس با اتانول شسته می شوند و وسایل هر بار استریل شده و سطوح گیاهی گرفته می شود و ریز گیاه به محل جدید استریل منقل می شوند.

روش ضد عفونی نمودن سطوح

یکی از معمول ترین روش های ضد عفونی می باشد. گیاهان با آب مقطر و بعد از آن با اتانول نشسته می شوند و سطوح با مواد شیمیایی مانند کلرین، هیپوکلراید سدیم یا کلسیم تیمار می شوند.

ضد عفونی بافت های نرم

1. ریز نمونه های گیاهی از گیاهان چند ساله را ۱ تا ۲ ساعت با آب شهری شستشو دهید.
2. سه تا چهار بار و هر بار ۵ تا ۱۰ دقیقه نمونه های گیاهی را با آب دو بار استریل، شستشو دهید.
3. در اتانول ۹۵ درصد به مدت ۳ تا ۵ ثانیه غوطه ور کنید.
4. یک بار دیگر با آب دو بار استریل، به مدت ۵ دقیقه شستشو دهید.
5. نمونه ها را در محلول دموستوس ۵ درصد، مدت ۲۰ تا ۲۵ دقیقه غوطه ور کنید (دموستوس: محلول ضد عفونی کننده خانگی یا وایتکس).
6. سه بار و هر بار به مدت ۱۰ دقیقه با آب دو بار استریل شستشو دهید.
7. عمل زه کشی را انجام دهید
8. ریز نمونه ها را تک تک به محیط کشت واسطه انتقال دهید.

ضد عفونی ساقه های چوبی

1. ساقه ها، جوانه ها و شاخساره ها را تهیه کرده و در دمای °۵ سانتی گراد نگه داری کنید.
2. نمونه ها را در اتانول به مدت ۳ تا ۵ دقیقه غوطه ور کنید.
3. به مدت ۱۰ دقیقه در محلول ۱ درصد هیپوکلراید سدیم غوطه ور کنید.
4. قطعات کوچکتر ساقه را در فلاکس های حاوی ۲ درصد ساکارز و ۲۰۰ پی.پی.ام سیترات هیدروکسی گیونولین در دمای ۲۳ تا ۲۵ درجه سانتی گراد قرار دهید.
5. قسمت پایینی ساقه را بریده و محلول را بعد از دو روز تعویض کنید.
6. بافت های نرم شاخساره های رشد کرده را قطع کرده و برای ریشه دهی یا ریز نمونه استفاده کنید.
7. مانند دستورالعمل فوق، عمل ضد عفونی کردن را انجام دهید.
8. ضد عفونی انبرک و اسکارپل در تمامی مراحل رشد و انتقال فراموش نشود.

مرحله II:

مرحله دوم، مرحله تکثیر می باشد که ریز گیاهها در محیط مناسب، جهت تکثیر کشت می شوند. هدف اولیه در این مرحله، تکثیر گیاه با ثبات ژنتیکی می باشد.

مرحله III:

قلمه هایی که از مرحله قبل به دست آمده اند با ریشه زایی تولید گیاه کامل می کنند. شاخساره، جوانه، غده های اضافی باید بعد از ریشه زایی، حذف شوند و به قبل از آن. بسیاری از گیاهان (مانند موز، آناناس، رزها، سیب زمینی، داوودی، توت فرنگی، نعناع و غیره) می تواند با محلول ۵۰ درصد ام اس به راحتی و بدون هیچ ماده تنظیم کننده دیگری ریشه دار شوند. مرحله ریشه زایی، مرحله ای گران و پر زحمت است که حدودا ۳۵ تا ۷۵ درصد هزینه کل را شامل می شود.

مرحله IV:

در این مرحله گیاهان تکثیر شده، نگهداری و مقاوم سازی می شوند. این آخرین مرحله در کشت بافت است که گیاهان تکثیر شده توسط ریز ازدیادی آماده انتقال به گلخانه هستند. مقاوم سازی با انتقال از شرایط با رطوبت بالا به رطوبت کم، صورت می گیرد. گیاهان ۳ تا ۶ روز در سایه نگهداری میشوند و بعد به محیط جدید منتقل می شوند.

وسایل و ادوات فیزیکی مورد نیاز در کشت بافت

در طراحی یک آزمایشگاه چه کوچک یا بزرگ، برای موفقیت بعضی وسایل ضروری و مورد نیاز است. علاوه بر این طراحی مناسب، موجب کاهش هزینه ها می شود. یک آزمایشگاه کشت بافت باید طوری طراحی شود که علاوه بر کاهش هزینه تمامی مراحل تکثیر، رشد و انتقال به سهولت انجام شود.

مکان و فضای مناسب کشت بافت

آزمایشگاه کشت بافت به تجهیزات مختلف و ویژه ای نیاز دارد. در این آزمایشگاه باید دما، تهویه، گرما و سرما قابل کنترل باشد. آب مناسب قابل تأمین باشد، زه کش به راحتی صورت گیرد. اگر چه با جداسازی اتاقک های مختلف از هم، هزینه ها بالا می رود، اما محیط آزمایشگاه تمیز بوده و ضد عفونی راحت تر صورت می گیرد. بهتر است کف آزمایشگاه، سرامیک شود یا بتون سیمانی ریخته شود. دیوارها و سقف آزمایشگاه باید عایق کاری شوند. سیستم گرمایی باید بتواند دمای آزمایشگاه را حدود ۲۰ درجه سانتی گراد در طول زمستان نگه دارد. یک لوله به قطر حداقل ۲ سانتی متر برای تأمین آب نیاز است. یک سیستم زهکش مناسب نیز مورد نیاز است. سیستم تهویه هوا نیز باید به دقت طراحی شود.

 سیستم برق آزمایشگاه برای تأمین الکتریسیته جهت نور و وسایل برقی باید محاسبه شود. اکثر وسایل برقی، برق220  ولت نیاز دارند و اتوکلاو ۲۳۰ تا ۲۵۰ ولت نیاز دارد. نواحی مانند اتاقک بیش تکثیر، اتاقک رشد و اتاقک تلقیح باید به عنوان نواحی تمیز جدا شوند. محل کار بایستی محلی مناسب و راحت باشد. محیط مناسب برای یک آزمایشگاه کوچک می تواند یک اتاق یا یک زیرزمین خانه، یک گاراژ و یا یک بالکن باشد. حداقل فضای مورد نیاز برای تکثیر، انتقال و رشد اولیه حدود ۱۴ متر مربع می باشد. قبل از احداث یک واحد تجاری تکثیر، باید آب و هوا، آب قابل دسترس، برق، تبخیر و تعرق و تجهیزات دیگر، به طور دقیق بررسی شود. علاوه بر این، میزان ریسک این کار دقیق بررسی شود. این واحد، باید در محلی احداث شود که جمعیت حشرات حداقل بوده، گرد غبار کم باشد و میزان گرده نیز پایین باشد. به طور کلی برای طراحی یک آزمایشگاه باید علاوه بر تجهیزات و وسایل گفته شده اصول زیر نیز در نظر گرفته شود:

• اتاق تهیه محیط کشت که دارای تجهیزات کامل و قفسه های متعدد است (۳۵ درصد مساحت کل).
• اتاقک شیشه ای استریل (محفظه تلقیح) (۱۵ درصد مساحت کل).
• اتاق کشت (۴۰ درصد مساحت کل ).
• الباقی مساحت برای نگهداری وسایل، اتو کلاو، ترازوها، یخچال و انبار میسلیوم و اسپان مادری (حدودا 10 درصد).

تجهیزات مورد نیاز و ضروری

ضدعفونی وسایل و لوازم نظیر انبرک، اسکارپل، تیغه و غیره نیاز به یک گاز مشتعل دارد که معمولا این لوازم در یک اتاقک نگه داری می شود. یک یخچال فریزر برای نگهداری مواد شیمیایی و محلول های غلیظ شیمیایی در حجم های بالاتر از ۱۰ گرم، میله مغناطیسی هم زن و یک پی اچ متر از دیگر لوازم مورد نیاز هستند. یک صفحه گرمایی نیز برای گرم کردن مواد قبل از اتوکلاو مورد نیاز است، یک pH متر نیز مورد نیاز است. البته بعضی از آزمایشگاه ها از کاغذهای تعیین کننده pH استفاده می کنند. یک پمپ خلاء نیز برای فیلتر آب شهری و ضد عفونی سطوح مختلف مواد گیاهی مورد نیاز است. یک آون نیز برای نگه داری و ضد عفونی اسکارپل ها، تیغه ها و ظروف آزمایشگاهی مورد نیاز است. تجهیزات متنوع غیر ضروری بسیاری در آزمایشگاه ها استفاده می شود. آون میکروویو (ریز موج) برای آب کردن یخ محلول های غلیظ و گرم کردن محیط کشت آگار و یک میکروسکوپ برای جداسازی قطعات کوچک گیاهی در اکثر آزمایشگاه ها استفاده می شود. یک شبکه تکان دهنده درکشت های مایع مورد نیاز است. اما در کل وسایل مورد نیاز یک آزمایشگاه کشت بافت عبارتند از :

• صندلی و میز محکم با سطح کاملا صاف.
• چراغ الکلی، چراغ بنسن یا یک شعله معمولی گاز بوتان برای تولید حرارت.
• بطری اسپری حاوی محلول سفید کننده ۱۰ درصد.
• تعدادی پتری دیش استریل و لوله آزمایش
• تعدادی برچسب، یک دفتر و خودکار.
• یک چاقوی آگار و حلقه تلقيح.
• یک دستگاه اتوکلاو یا زودپز معمولی (بخار تحت فشار).
• pH سنج یا کاغذ تورنسل معمولی.
• الكل ۹۶ درصد و دیگر مواد ضدعفونی هم چون وایتکس، فرمالین …
• قفسه برای ظروف کشت، جا لوله ای و غیره. تمامی این اجزاء بایستی درون آزمایشگاه بماند و در صورت خروج یکی از آنها به بیرون، هنگام برگشت آن به داخل آزمایشگاه باید از تمیز بودن آن، مطمئن شد.

اتوکلاو: معمولا یک اتوکلاو اندازه بزرگی دارد، اما می توان از یک زودپز خانگی نیز برای استریل کردن وسایل و محیط کشت استفاده کرد. اتو کلاوهای با اندازه های مختلف در دسترس هستند. دما با فشار بالا برای ضدعفونی محیط کشت، آب و وسایل دیگر مورد نیاز است. اسپور بعضی قارچ ها و باکتری ها فقط در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار kg/sq.cm 1.05 کشته می شوند.

هود لامینار با تهویه هوا: یک لامینار با فیلترکردن هوای محیط، یک هوای تمیز در اختیار قرار میدهد. چندین نمونه با اندازه های مختلف از لامینار در بازار موجود است. نواحی و امکانات موجود برای فعالیت ها در مراحل مختلف کشت بافت می تواند به کمی تمیز، تمیز و فوق تمیز تقسیم شود. نواحی تمیز شامل اتاقک ضد عفونی و اتاق استراحت است که نیازی به ضد عفونی ندارد. نواحی تمیز شامل اتاقک ضد عفونی و اتاقک تکثیر است که باید به طور سطحی ضد عفونی شود. ضد عفونی بالا برای نگه داری محیط های کشت در اتاقک رشد و اتاقک انتقال می باشد که جزء مناطق با ضد عفونی بسیار بالا است.

نواحی نگهداری و شستشوی ظروف شیشه ای: این نواحی باید در نزدیکی اتاقک های تمیز و ضدعفونی قرار گرفته باشند. این نواحی باید حداقل یک سینک بزرگ داشته باشند که البته دو عدد سینک بهتر است. یک شبکه یا صفحه پلاستیکی را می توان در سطوح نزدیک سینک جهت افزایش زه کش و همچنین کاهش شکستن ظروف شیشه ای قرار داد. آب گرم و سرد باید در دسترس باشد و دستگاه دیولیزاسیون نیز نزدیک آن واقع شده باشد.

انبار: بسیار مناسب است که ناحیه ای را برای ذخیره مواد شیمیایی، لوازم و تجهیزات اختصاص دهیم. که نه تنها موجب دسترسی آسان به مواد مورد نیاز می شود، بلکه از فضا حداکثر استفاده را می کنیم.

اتاق تکثیر و ضد عفونی: اتاق رشد باید دارای کف و دیوار صاف باشد. دارای حداقل پنجره و در باشد. اتاق رشد و اتاق ضدعفونی را می توان در یک محل احداث نمود، اما بهتر است این دو اتاق از هم جدا باشند. میز کار باید دارای ارتفاع ۸۵ تا ۹۰ سانتی متر باشد و جهت شستشوی مکرر باید دارای سطحی از جنس پلاستیک باشد.

اتاق انتقال: این ناحیه مهم ترین محل کار در کشت بافت می باشد. محل انتقال باید تا جایی که امکان دارد، تمیز باشد و دارای اتاقی جدا و با حداقل جابه جای هوا باشد (هوا باید راکد باشد). دیواره ها و کف اتاق رشد باید صاف باشد. میزان نور خاصی در اتاق انتقال مورد نیاز نمی باشد. نور اتاقک لامینار برای کار کردن کافی به نظر می رسد.

اتاق رشد: این اتاق به اندازه محيط کنترل شده برای رشد گیاه، مهم و ضروری است. بهتر است به دلیل داشتن نیاز نوری و دمای واریته های مختف گیاهی بیش از یک اتاق رشد داشته باشیم. در این جا نیز تعداد درب و پنجره ها در حداقل تعداد هستند. در اتاق رشد به پنجره نیازی نمی باشد، مگر خواسته باشیم از نور طبیعی استفاده کنیم.

کنترل رشد: جهت داشتن رشد مناسب گیاهی، باید میزان نور، دما و رطوبت نسبی و شیب اتاق رشد را کنترل کنیم. که این موارد به اندازه اتاق رشد موقعیت آن و نوع گیاهی که کاشته شده است، بستگی دارد.

کنترل دما: دما جزء نگرانی های اولیه در اتاق رشد می باشد. دما در اتاق رشد معمولا با شرایط هوای کنترل می شود. معمولا دما حدود ۲۲ درجه سانتی گراد نگه داشته می شود. در بیشتر کشورهای در حال توسعه، سرد کردن اتاق رشد معمولا مشکل به مراتب بزرگتری از گرم کردن آن می باشد.

کنترل نور: بعضی از گیاهان را می توان در محیط کاملا تاریک نگهداری کرد، اما اکثر اتاق های رشد به میزان نوری حدود ۱ کیلو لوکس نیاز دارند. گونه های مختلف گیاهی و یا زمان تکثیر، تعیین کننده شدت نور مورد نیاز می باشند. ریشه زایی به شدت تحت تأثیر نور فروسرخ قرار می گیرد. طیف وسیعی از نور باید در مرحله سوم و نور سفید ملایم در طول مرحله اول و دوم مورد استفاده قرار گیرد.

قفسه بندی: قفسه بندی اتاق رشد بستگی زیادی به موقعیت و رشد گیاهی دارد. چارچوب ها را می توان با آهن های به ضخامت 1.25 سانتی متر ساخت. البته چوب نیز می توان برای این منظور استفاده کرد که چوب مورد استفاده باید دارای سطحی صاف باشد و با رنگ سفید جهت منعکس کردن تابش نور، رنگ آمیزی کرد.

ساختمان گلخانه: یک مرحله حیاتی در کشت بافت مرحله جابه جایی از آزمایشگاهی به مزرعه می باشد.گیاهان حاصله از کشت درون شیشه باید یک دوره مقاوم سازی جهت انتقال به شرایط مزرعه را سپری کنند.مقاوم سازی گیاهی را معمولا در گلخانه انجام می دهند که موجب افزایش تعداد گیاهان زنده در مزرعه می شود. معمولا ۳ نوع گلخانه، زمین به زمین، گل خانه دیواری یا سه گوش ، گل خانه کوانست برای این مقصود استفاده می شود. اندازه گلخانه به حجم تولید بستگی دارد.

کنترل آلودگی: از دست دادن کشت هر گیاه، هزینه های تولید را افزایش می دهد. از عوامل ایجاد آلودگی محیط کشت، آلودگی های طبیعی می باشند. مانند گرد و غبار، ذرات معلق در هوا، اسپورهای قارچ ها و باکتری ها و موی سر. آلودگی های بدنی عمدتا از بدن، لباس و کاستی در مراحل مختلف آزمایشگاهی می آید. پوشیدن لباس آزمایشگاه موجب کاستن آلودگی های ناشی از بدن، پوست و مو می شود.

شستشو و ضد عفونی کردن وسایل کار: به جای استفاده از آون های گران قیمت، برای شستشوی ظروف کشت می توان از نور خورشید استفاده کرد. در آزمایشگاه های کوچک می توان از زودپز خانگی به جای آون گران قیمت استفاده کرد.

نگهداری گیاهان کشت شده در اتاق های رسد: گیاهان کشت شده را می توان به جای نگه داری در اتاقک های رشد گران قیمت، در اتاق های دارای تهویه یا تونل های پلاستیکی نگهداری کرد. روش های قدیمی دارای سیستم های نوری رو به پایین را می توان با سیستم های نوری از اطراف جایگزین کرد که نه تنها موجب کاهش تعداد لامپ ها می شود، بلکه موجب یکنواختی بیش تر نور محیط کشت نیز می شود.

تکنیک های آلوده در کشت بافت: در اطراف ما اسپورهای قارچی و سایر میکرو ارگانیسم ها قرار دارند. زمانی که یک اسپور در مجاورت محیط کشت قرار می گیرید، شرایط برای رشد و جوانه زدن آنها مهیاست. هودهای ترانسفر تحت شرایط فشار بالایی عمل می کنند و به فیلتر های هوای فوق العاده موثر (HEPA)مجهزند که تقریبا ۳ اینچ ضخامت دارند. فیلترهای HEPA %99/99 درصد در انتقال موادی به اندازه 0.3 میکرول و یا بیشتر موثرند ولی باکتری و اسپورهای قارچی توسط این فیلترها شکار می شوند. اگر شما از تکنیک های صحیح جهت کار کردن درون این هودها استفاده کنید آلودگی کشت های بافت گیاهی واقعا می تواند حذف شود. نکات زیر در به حداقل رساندن مشکلات کمک خواهد کرد:

• ساعت و جواهرات خود را در آورید و دست هایتان را بشویید.
• اسپری کردن زیاد دست ها و بازوهایتان با اتانول ۷۰ درصد مهم است.
• هر چیزی که وارد هود ترانسفر می شود، باید استریل شود. اسپری کردن تک تک ابزارها، شیشه ها و سایر ظروف با اتانول ۷۰ درصد مهم باشد.
• در موقعیتی قرار گیرید که صورت تان در ارتباط با جریان هود حداکثر دستهایتان را بیرون از هود نگه دارید. برای دسترسی به داخل هود حداکثر بازوهایتان را دراز کنید اما بازوهایتان را روی سطح کار قرار ندهید.
• اگر ضروری باشد که سرفه یا عطسه کنید، لطفا این کار را به طرف هود انجام ندهید.
• پنس ها، چاقوها و سایر ابزارها را تک به تک روی شعله بگیرید. ابزارها را در الكل ۹۵ درصد قرار داده و سپس به مدت کوتاهی از روی شعله بگذارید. الكل ها در بار دوم گرما دادن ابزارها برای استریل کردن آن ها ضروری نیست و چاقوها و پنس های گرم به بافت گیاهی آسیب خواهند رساند.