کشت بافت گیاهان زینتی (بخش اول)

تولید مثل غیر جنسی به روش کشت بافت را ریز ازدیادی یا تکثیر کلنی می گویند. در حال حاضر فن آوری ریز ازدیادی به طور تجارتی با سود بسیار عالی برای تولید هر ساله میلیون ها نهال در سراسر جهان مورد بهره برداری قرار می گیرد. ریزازدیادی به علت تولید گل ها و نهال های یکنواخت در مدت زمان های نسبتا کوتاه و در فضای تقريبا اندک اهمیت اقتصادی فراوانی کسب کرده است. فنون کشت بافت برای ازدیاد گیاهان یکی از مهیج ترین و با اهمیت ترین فعالیت های این علم است که از طریق باززایی اتفاقی  (میان گره، لبه ی برگ، لپه، منطقه ی رشد طولی ریشه که به طور طبیعی مریستم تشکیل نمی شود) و نوپدید (پینه ها و یاخته ها) تحقق می یابد. این روش در حال حاضر برای بسیاری از گیاهان زینتی و گل دار مانند ارکیده، رز، سبزیجات، سیب زمینی و درختان میوه مانند اوکالیپتوس در حال بهره برداری است.کشت بافت گیاهی به معنای رشد و تکثیر سلول ها، بافت ها و ارگان های گیاهی روی محیط جامد یا مایع تحت شرایط ضد عفونی شده و تحت کنترل می باشد یا به عبارتی کشت سلول، بافت، پروتوپلاست و اندام های گیاهی در شرایط استریل شده و در محیط غذایی مصنوعی در داخل لوله آزمایش می باشد. اکنون این فناوری به عنوان یک روش پایه ای و یک ابزار محوری بسیار عالی در تکثیر و اصلاح نژاد گونه های گیاهی مهم اقتصادی موقعیت ویژه ای را کسب کرده است. کشت بافت گیاهی در کشاورزی و باغبانی نیز کاربردهای عملی فراوانی دارد. آزمایشگاه های ریز ازدیادی سالیانه میلیون ها نهال درختان و گیاهان زینتی را تولید و به بازار عرضه می کنند. کشت انتهای شاخه یا مریستم به منظور تولید گیاهان عاری از ویروس به طور گسترده ای در حال اجراست. کشت بساک، تخمک و امتزاج پروتوپلاست ها در به نژادی با کاهش مدت زمان لازم و افزایش کارایی انتخاب، سرعت عمل را زیاد کرده است و علاوه بر این روش خوبی در درک فرایندهای ژنتیکی، فیزیولوژیکی، بیوشیمیایی و زیست شناسی مولکولی به شمار می رود. از طرف دیگر گیاهان تراریخت که از انتقال DNA خارجی به سلول ها و پس از باززایی گیاهی حاصل می شوند، به سرعت در حال پیشرفت است و تأثیر این محصولات در سلامت انسان در کشورهای اروپایی و آمریکایی تردیدهایی را برانگیخته است. اگر چه دامنه ی چنین جنبش هایی به آسیا و آفریقا کشیده نشده است اما به منزله ی هشداری برای همه ی ملل جهان تلقی می گردد.

یکی از اهداف اصلی این روش بر مبنای تکوین گیاهان ترانسژنی مقاوم به حشرات، بیماری ها، خطر سرما و علف کش ها استوار است. هم جوشی پروتوپلاست ها (سلول های فاقد دیواره) امکان تلاقی بین گونه ای را مقدور می سازد. این روش برای تلاقی های بین گونه ای اهلی و وحشی اهمیت زیادی دارد، زیرا اولا نسل اول آنها فاقد رویان تکامل یافته و غیر قابل رویشند و دوما گونه های وحشی معمولا دارای ژن های کنترل کننده مقاومت به آفات و بیماری ها و شرایط محیطی می باشند. علاوه بر این در بعضی از روش های انتقال ژن و تهیه پیش دش ها یک مرحله ی ضروری بوده و دریچه ی تازه ای در به نژادی گیاهان زراعی گشوده است. روش های کشت بافت مبتنی بر دو مرحله تمایز زدایی و تمایزیابی می باشد.

سلول ها، بافت ها و اندام های گیاهی در طی مرحله تمایززدایی، توده های سلولی بی شکل و متراکمی به نام کالوس را تولید می نمایند و سپس در شرایط غذایی و محیطی مناسب تمایز یافته و بافت های مختلفی را ایجاد نموده و گیاهان کاملی را به وجود می آورند. به همین دلیل کشت بافت در مسائل مربوط به رشد و تمایزیابی تحت شرایط باز تولیدی به آزمایش های گیاهی کمک گرانبهایی کرده است. کشت بافت در کشاورزی و باغبانی نه تنها به منظور تکثیر گیاهان بلکه اهداف مربوط به جذب مواد غذایی خاک، مقاومت به شوری خاک، حذف عوامل بیماری زا، حفظ ذخایر گیاهی ارزشمند در کشت ها و در درجه حرارت های پایین و به نژادی گیاهان کاربردهای عملی بسیار وسیعی پیدا کرده است. اهمیت کشت بافت گیاهی به اندازه ای است که بسیاری از دانشگاه های دنیا آن را در دوره های آموزشی پیشرفته و مقدماتی خود گنجانیده اند و حتی در بعضی از کشورها دوره های تخصصی ریزازدیادی را در سطح تولید سازماندهی کرده اند.

نظریه پرتوانی که در سال ۱۸۳۸ توسط اشلایدین و شوآن پیشنهاد شد، نیروی محرکه ی اصلی توسعه ی این شاخه ی بیوتکنولوژی بوده است. پر توانی سلولی عبارت است از این که سلول های گیاهی در وظایف شان خودسازند و در اصل استعداد باززایی و تولید گیاه کامل را در خود دارند. در ابتدا این نگرش فقط در سلول های تخم و هاگ تأیید شد. پس از گذشت مدت زمان طولانی برای سلول بدنی نیز به اثبات رسید. بنابراین، پرتوانی به عنوان یکی از نشان ویژگی های سلول های گیاهی، توان بالقوه ی بزرگی در به دست آوردن نوترکیب های ژنتیکی محسوب می گردد که با صرف زمان و دشواری های بسیاری با روش های به نژادی سنتی امکان پذیر نبوده است. پس واژه توتی پوتنسی سلول های ویژه هر گیاه این توانایی را دارند که پس از جدا شدن از گیاه و رشد کردن، تولید یک گیاه کامل بکنند، یعنی هر سلول توانایی تبدیل شدن به گیاه کامل را دارد. یک گیاه عنکبوتی معمولی است که قادر است از انتهای هر شاخه، تولید گیاه جدید کند.

کشت بافت گیاهی بر اساس چنین اصولی استوار گردیده و به سرعت در حال گسترش و ترقی می باشد. رواج و کارآیی بالقوه ی روش های کشت بافت در به نژاد گیاهی عبارت است از:

• تکثير گروهی
• حذف عوامل بیماری زا
• نگهداری ذخایر توارثی به مدت زمان طولانی
•  تولید گیاهان هاپلویید
• ایجاد و انتخاب تغییرات ژنتیکی
• تولید محصولات ثانویه
• انتقال ژن
• دورگ گیری بین گونه ای
• مهندسی ژنتیک مولکولی گیاهی و غیره

تکنولوژی کشت بافت برای تولید گیاهان دابل هاپلویید، نگهداری و حفاظت از منابع گیاهی، تکثیر گیاهان جدید، حفظ و نگهداری گیاهان کم یاب و در معرض انقراض، تکثیر گیاهانی که تولید مثل مشکل دارند و تولید متابولیت های ثانویه و گیاهان تراریخته استفاده می شود. مزیت عمده کشت بافت، تولید گیاهان با کیفیت بالا و یکنواختی می باشد که می تواند در شرايط خارج از فصل و عاری از بیماری تولید شوند. به هر حال، این تکنولوژی پر هزینه، آزمایشگاهی و پر مشقت می باشد. انرژی مورد نیاز برای کشت بافت بستگی به دمای روز، طول روز و درصد رطوبت نسبی که باید در طول دوره تکثیر کنترل شوند، دارد.

به طور کلی امتیازهای روش ریز ازدیادی را می توان در موارد زیر خلاصه کرد:

• گیاهان تکثیر شده به روش کشت بافت از قدرت رشد بالایی نسبت به گیاهانی که به روش های سنتی تکثیر می شوند برخوردارند
• ازدیاد آن گروه از گیاهانی که با روش های سنتی به سختی تکثیر شده و یا از نظر اقتصادی مقرون به صرفه نیستند
• تکثیر و تولید تعداد زیادی از کلون های با ژنتیک معین
• بذور از ریسک کمتری برای جوانه زدن برخوردارند
• آزاد شدن از قیود اقلیمی موجود از نظر فصل و زیستگاه و در تمام طول سال می توان گیاه تولید کرد
• حمل و نقل مواد گیاهی را راحت تر می کند
• نگه داری دراز مدت و میان مواد گیاهی
• تکنیک های کشت بافت در تولید گیاهان عاری از ویروس، دست کاری ژنتیکی، هیبریداسیون سوماتیکی، به نژادی گیاهان و مطالعات پایه استفاده می شوند

منابع ریز نمونه و روش های کاشت سلول و بافت

کشت بافت گیاهی با قطعات بسیار کوچکی به نام ریز نمونه شروع می شود که از هر قسمت گیاه گرفته می شود. عملا همه قسمت های گیاهی به طور موفقیت آمیز برای تهیه ریز نمونه استفاده میشوند. چندین روش مختلف برای کشت سلول و کشت بافت وجود دارد. که در زیر به آنها اشاره می شود:

کشت کالوس

كالوس زایی یک مرحله ی بسیار مهمی از کشت بافت را تشکیل می دهد و تولید کالوس های جنین را که دارای قابلیت باززایی گیاهی باشند همواره با محدودیت هایی مواجه بوده است. از این گذشته در مطالعات کالوس زایی دو عامل مهم ژنتیک و محیط (غذا، نور و حرارت) بیش از همه مورد توجه قرار می گیرد ژنتیک های یک گونه یا زیر گونه پاسخ های متفاوتی نسبت به کشت نشان می دهند. برای تولید کالوس از کشت قطعات یک بافت نامتمایز یا کاملا تمایز یافته و تبدیل آن به یک توده یاخته ای تمایز نیافته با ساختاری بی سازمان در محیط های غذایی مصنوعی نیمه جامدی که محتوی همه ی مواد غذایی پر مصرف، کم مصرف و ساکارز به اضافه ی ترکیبات تنظیم کننده رشد به ویژه NAA , IAA , 2,4-D  کینیتین و یک ژل نیمه جامد کننده باشد، استفاده می شود. قسمت هایی از گیاه که می تواند کشت شود شامل قطعات ساقه، ریشه، میان برگ (مزوفیل)، لپه، نوک شاخه، بافت گل، كامبيوم آوندی، فلس های پیازی، درون دانه، محور رویان، اشعه مرکزی، پارانشیم آوندی، سپرچه، محور زیرلپه، بساک، ریز هاگ و تخمک یا تخمدان می باشد. اگر چه اندازه، شکل، منابع گیاهی یا زادمون گیاه و شیوه ی کشت در القای تشکیل کالوس تأثیر به سزایی دارد اما هر نوع قطعه ی زیر کشتی در شرایط محیط غذایی با ترکیبات ویژه ای و دوره نوری خاصی به کشت پاسخ می دهد. دانشمندان سی  سال پس از شناسایی ترکیب 2,4-D  به خواص هورمونی آن پی بردند و از آن در تمایز زدایی و تولید کالوس استفاده کردند، در حال حاضر استفاده از این هورمون در کالوس زایی به طور وسیعی رواج یافته است.

در اغلب گیاهان و قطعات زیر کشت، القای پینه در ۲۵ درجه سانتی گراد و در تاریکی انجام می شود. کالوس زایی از نشان ویژگی های وراثتی محسوب می گردد. علاوه بر این عوامل فیزیولوژی، منابع گیاهی، محیطی و تیمار سرمایی پیش از کشت به ویژه در کشت های مربوط به بساک و ریز هاگ و تخمک اهمیت زیادی دارد.

کشت باززایی

سلول های کالوس به منظور شاخه زایی و تولید گیاه کامل به محیط های غذایی دیگری که از نظر ترکیبات به ویژه میزان و نوع هورمون ها با محیطهای غذایی کالوس زایی متفاوتند، در شرایط استریل شده انتقال می یابند.

 با تغییر نسبت تنظیم کنندگان رشدی می توان برای هر منبع گیاهی، محیط غذایی باززایی مناسبی که بیشترین بازدهی کشت را داشته باشد، تهیه کرد. در تمایزیابی پینه ها و به وجود آمدن اندام های نوپدید برای هر ژنتیک دوره ی نوری و درجه حرارت معینی پیشنهاد شده است. همه ی کالوس ها برای تبدیل شدن به گیاه کامـل مناسب نیستند و فقط کالوس های جنین زا که اغلب دانه ای شکل، مدور، خشک و زرد کم رنگ هستند،  بهتر پاسخ می دهند. کالوس های جنین را پس از عمل تمایزیابی، اندام های اولیه ای را به وجود می آورند که سپس به شاخه ها، ریشه ها، گلها، جوانه ها و رویان ها تبدیل می گردند. در غلات محدودیت هایی از نظر باززایی گیاهان زال مشاهده می شود که گاهی ۹۰ تا ۹۵ درصد تولید گیاه را در بر دارد و برای جلوگیری از این پدیده نامناسب، تحقیقاتی در حال انجام است. باززایی پینه از مسائل بسیار پیچیده کشت بافت بوده که در تعداد زیادی از گیاهان، بـدون حـل باقی مانده است. متأسفانه تعداد زیادی از پینه های گونه ها و هم جوشی بین گونه ای گیاهـان بـه بـاززایی پاسخ نمی دهند.

 بازآیی و اندام زایی

در این روش، گروهی از سلول ها مانند مریستم نوک ساقه، جوانـه هـای جـانبی، نوک ریشه و جوانه گل تمایز پیدا کرده، تولید شاخساره کرده و نهایتاً گیاه کامل را به وجود می آورند. در بسیاری موارد، جوانه های جانبی مرتباً تکثیر شده و تعداد زیادی گیاه کوچک را ایجاد می کنند. گیاهان از هم جدا شده و سپس در مرحله بعد ریز ازدیادی، ریشه دار می شوند (در خزانه، گلدان های کوچک، در گلخانه یا در تونل های پلاستیکی با درصد رطوبت بالا). ریز گیاه ها معمولاً در حجم بالای اکسین (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) کاشته می شوند. کالوس ها در محیط کشت مایع تکان داده می شوند و ایجاد سوسپانسیون می کنند. در بعضی موارد، بافت اپیدرم و پهنک برگ نیز می توانند به طور مستقیم بدون ایجاد کالوس، تولید ارگان ها و جنین سومانیکی (رویشی)کنند.

جنین زایی سوماتیکی (رویشی)

در این روش، سلول ها یا بافت ها روی یک ماده جامد یا در یک کشت سوسپانسیونی، کاشته می شوند. جنین رویشی اولیه قادر است جنین های ثانویه بیشتری تولید نماید. این روش برای تعداد زیادی گیاه و درختان استفاده شده است، اما در سطح تجاری به چند گیاه ماننـد هـویج، نخـل و چند درخت جنگلی محدود شده است.

بذور مصنوعی

عقیده تولید و استفاده از بذور مصنوعی (جنین رویشی به عنوان جای گزین بذور حقیقی) برای اولین بار توسط موراشیگ در سال ۱۹۷۷ میلادی پیشنهاد شد. استفاده موفق از بذور مصنوعی به عنوان ابزاری برای تکثیر، بستگی زیادی به سیستم تولید و مراقبت های زیاد پس از تولید دارد. پوشش های مصنوعی وکپسول های ژل مانند حاوی نیتروژن، آفت کش و مواد مغذی به عنوان جایگزین پوشش (پوسته) بذر استفاده می شود. به هر حال این روش هنوز در ابتدای راه توسعه بوده و هنوز مانند دیگر روش ها به صورت تجاری در نیامده است.

کشت بساک و ریز هاگ

فنون کشت بساک و ریز به عنوان یک ابزار اصلاحی کارآمد و صرفه جویانه ای در تولید خط های هوموزیگوت گیاهی در مدت زمان کوتاه در به نژادی مورد استفاده قرار می گیرد.گرده ی نارس یا ریز هاگ موجود در بساک در کشت های یک مرحله ای مستقیم تولید گیاه را می نماید و در حالت دو مرحله ای ابتدا پینه را تولید می کند و سپس در شرایط غذایی دیگری با نسبت هورمونی متفاوتی به گیاه باززایی می شود. ریز هاگ های داخل بساک هاپلوییدند و نیمی از کروموزوم های بدنی را در اختیار دارند. هنگامی که در فرایند کشت بساک به سلول های کالوس و سپس به گیاه کامل تبدیل می گردند، یاخته های بدنی آنها، تماما هاپلویید و در نتیجه گیاه هاپلویید خواهد بود و از آن جا که این گیاهان نمی توانند تقسیم میوز را انجام دهند، از طریق بذر قابل تکثیر نیستند (در مواردی که کالوس ها از دیواره بساک به وجود آمده باشند و یا به طور خود به خودی دیپلویید شده باشند و تولید بذر نمایند، بارورند). بنابراین، این گیاهان باید تحت اثر ماده شیمیایی کلشی سین به گیاهان دیپلویید تبدیل گردند که در آن کروموزوم ها به صورت جفت های مشابه وجود خواهند داشت و هاپلویید دو برابر با دیپلوییدهای نرزاد (گیاهان گرده ای) جور تخم و خالص اند و در خط های به نژادی به منظور بروز صفات ژنتیکی مغلوب ساده با جهش یافته مورد استفاده قرار می گیرند. برتری این روش در مقایسه با دورگ گیری سنتی عبارت است از :

1. کاهش مدت زمان لازم به نژادی با تثبیت جور تخمی
2. افزایش بازدهی انتخاب به دلیل احتمال بروز سریع ژن های مغلوب و پایداری ژن های نوترکیب بیشتر
3. تغییر پذیری وسیع زاد شناختی از راه تولید گوناگونی های گامتوکلونی
4. حل مشکل عقیمی در تلاقی های دور

تاکنون کشت بساک بیش از دویست گونه گیاهی شامل غلات (جو، ذرت، چاودار، تری تیکال، گندم و غیره)، درختان میوه (سیب، گلابی، گیلاس، مرکبات و به)، درختان جنگلی (صنوبر و اوکالیپتوس)، سبزیجات (كلم، هویج، خیار، ترب، بادمجان)، گیاهان زراعی (چغندر و توتون) و گیاهان دارویی نیز به کشت بساک پاسخ داده اند. تاتوره اولین گیاهی بود که کشت بساک آن انجام شد. بازدهی کشت بساک به طور وسیعی به ژنتیک و ساختار ژنتیکی گیاه مادری و محیط کشت و شرایط نوری و درجه حرارت اتاق بستگی دارد. در کشت بساک غلات مدت زمان و درجه حرارت دوره سرمادهی و غلظت هورمونی محیط غذایی کشت در میزان تولید گیاهان سبز تأثیر می گذارد. از مطالعه باززایی کالوس های حاصل از نسل اول دورگ ها می توان چنین استنباط کرد که قابلیت باززایی یک توارث وراثتی است و توسط ژن هایی هدایت می شود. از این گذشته در کالوس هایی که به منظور انتقال ژن با ذرات طلای آغشته به DNA خارجی بمباران می شوند و پینه هایی که از پروتوپلاست های امتزاج  یافته حاصل می گردند، باززایی به سختی انجام می شود، کالوس زایی و باززایی از مباحث اصلی پیشرفت و ترقی این علم محسوب می گردد که فایق آمدن بر پیچیدگی ها و موانع آن ها پشتوانه قدرتمندی را در عرصه های کشاورزی نوین فراهم خواهد کرد. به دلیل پایین بودن میزان پاسخ گیاهان به کشت بساک، دانشمندان تمام کوشش خود به بهبود محیط های غذایی کشت و بررسی ژنتیک های گیاهی و یک مرحله ای کردن کشت متمرکز ساخته اند. کشت بساک اولین بار در غلات و توسط نی ای زیکی (۱۹۶۷) در برنج انجام شد و تاکنون موفقیت های چشم گیری حاصل گردیده است، اما پاسخ اندک به کالوس زایی و باززایی و فراوانی گیاهان زال  از مشکلاتی هستند که محققان با آنها روبرویند.

کشت جنین

هنگامی که دامنه وسیعی از گونه های گیاهی برای کارهای عملی دورگ گیری مورد استفاده قرار می گرفت، کشت جنین به عنوان یک ابزار با ارزشی برای تولید گیاهان دورگ در تلاقی های دور رواج یافت. امروزه برای غلبه بر خواب بذر و عقیمی آن، نجات جنین تلاقی های دورگ های ناسازگار و باززایی گیاه در داخل لوله آزمایش از روش کشت جنین نارس استفاده می شود. در این حالت جنین از بذور نارس یا نزدیک به مرحله ی بلوغ جدا شده و در محیط غذایی مصنوعی کشت می شود. علاوه بر استفاده از این روش در تلاقی های بین گونه ای و بین جنسی که معمولا در مرحله نارسی انجام می شود، از آن می توان برای تولید کالوس های جنینن زا از جنین نارس و رسیده به منظور تهیه پروتوپلاست با انتقال ژن و DNA که در بیوتکنولوژی مورد توجه فراوان قرارگرفته است، سود برد. با به کارگیری روش نجات جنین دوره به نژادی از چندین سال به چند ماه کاهش یافته است و تلاقی های بین گونه ای در تعدادی از گیاهان مهم اقتصادی مانند پنبه، جو، گوجه فرنگی و برنج به طور موفقیت آمیزی توسعه یافته است. کشت جنین نارس فقط در محیط های غذایی ویژه ای پاسخ می دهد و عواملی مانند افزایش فشار اسمزی، میزان پتاسیم زیاد، بالا بودن نیتروژن به شکل نمک آمونیوم اسیدهای آلی، اسید آبسیزیک و کاهش فشار اکسیژن، جوانه زنی زودرس را به تعویق می اندازند. بنابراین علاوه بر رعایت اصول کلی تهیه محیط های غذایی کشت جنین بایستی به مواردی که در بالا اشاره شد نیز توجه نمود.

کشت پروتوپلاست

پروتوپلاست ها سلول های لختی هستند که دیوارهای سلولی آنها به روش مکانیکی با آنزیمی حذف شده باشد. موفقیت در تهیه پروتوپلاست ها به مرحله ی فیزیولوژی منبع گیاهی، آنزیم های مورد استفاده و فشار أسمزی محیط غذایی کشت بستگی دارد. سوسپانسیون یاخته ای منبع اصلی کشت پروتوپلاست است که از کشت کالوس های حاصل از سلول های جنسی و بدنی شامل ریز هاگ، تخمک، رویان نارس و رسیده، ریشه، برگ، ساقه، گره و سپرچه (کلئوپتیل)، غده و دم برگ در محیط غذای مایع تهیه شده و سپس در محیط های غذایی محتوی آنزیم های سلولاز، پکتیناز، ماسرو زایم، اسیدهای آمینه، بازهای اسید نوکلئیک، هورمون ها، اسیدهای الى، قند، قند الكل ها، آب نارگیل دیواره ی یاخته ای حذف می گردند و یاخته های مدور فاقد دیواره به دست می آیند. بازدهی و زیستایی پروتوپلاست ها یعنی توانایی تولید مجدد دیوارهای یاخته ای و آغاز تقسیم یاخته، به عوامل گوناگونی نظیر روش تهیه پروتوپلاست، شرایط فیزیولوژی منابع گیاهی (نمونه زیر کشت و شرایط رشد) نوع و غلظت آنزیم ها، ترکیب محیط غذایی کشت، استحکام غشای پلاسمالما و غیره بستگی دارد. از بعضی اندام های گیاهی به ویژه برگ می توان مستقیما پروتوپلاست ها را تهیه کرد. این سلول ها به علت از دست دادن خاصیت نیمه تراوایی خود بایستی در محیط غذایی ویژه ای که فاقد آنزیم ها و مواد تجزیه کننده سلولزی و پکتینی است، قرار گیرند و پس از چند روز دیوارهای سلولزی را باززایی نمایند و آن گاه در محیط های غذایی پینه زایی و باززایی کشت شده و گیاه کاملی را تولید نمایند. باززایی گیاهی از پیش دیش ها وسیله ی پرارزشی را در به نژادی گیاهان زراعی فراهم کرده است. دورگ گیری سلول های بدنی به روش امتزاج پروتوپلاست ها انجام می شود و کاربرد آن عبارت است از:

1. تولید گیاه از دورگ های بین گونه ای با ناسازگاری جنسی
2. تولید دورگ های سیتوپلاسمی (سیبرید) و انتقال ژن کلروپلاست از یک والد و میتوکندری از والد دیگر و دسترسی به تغییرپذیری سیتوپلاسمی شامل نوترکیبی بین اندامک های یاخته ای به ویژه میتوکندری.
3. تولید خط های نرعقیم سیتوپلاسمی
4. انتقال DNA، اندامک های یاخته ای نظیر کلروپلاست ها، کروموزوم های جدا شده، باکتری ها، پلاسمیدها و غیره به منظور ایجاد گوناگونی های زاد شناختی یاخته ها، تراریختی پیش دیش ها با استفاده از هم جوشی آن ها با پلاسمید Ti جدا شده فعالیت جالب توجه دیگری برای انتقال ژن است.

از امتزاج پروتوپلاست ها، دورگ های هسته ای و سیتوپلاسمی حاصل می گردد که باززایی آنها در مراحل مختلف تقسیم یاخته و در حین کالوس زایی و تشکیل گیاه می تواند رخ دهد. این دورگ های بدنی ژن های هسته هر دو والد و سیتوپلاسم هر دو یا فقط یک والد را دارند. بنابراین در گیاهان حاصل از دورگ های بدنی تفرق صفات وجود دارد و در نتیجه چنین گیاهانی دارای ژن های هسته ای هر دو والد و سیتوپلاسمی یک والد را می توانند همراه داشته باشند.

سوسپانسیون سلولی

قسمت های مختلف گیاه مانند پهنک برگ، قسمت های کوچک ساقه، جنین نارس، دانه گرده، پرچم، میکروسپور و تخمک بایستی کاشته شوند تا ایجاد کالوس کنند. یک کالوس، یک توده از سلول هایی است که سازماندهی نشده اند که حد وسط مناسبی هستند که قادرند تولید شاخساره و جنین سوماتیکی کرده و بعد از آن یک گیاه کامل را ایجاد کنند. در کشت مایع کالوس برای ایجاد شاخساره روی تکان دهنده قرار می گیرند. کشت های سوسپانسیون سلولی عموما به منظور تهیه سلول ها یا توده هایی از آن به شکل سلول های منفرد و جدا از هم، از کشت بافت ها و كالوس ها در محیطهای غذایی مایع و در حال به هم زدن روی تکان دهنده های مکانیکی در درجه حرارت ثابت و شرایط نوری تعیین شده انجام می شود. سلول های کالوس در محیط غذایی مایع به دلیل تماس نزدیک با مواد غذایی و هورمون ها دارای میزان رشد و تکثیر بیشتری نسبت به محیط نیمه جامدند و در زمان های تعیین شده (برای کالوس های برنج هر ۴-۷ روز) باید واکشت شوند تا اولا محیط غذایی تازه در دسترس سلول ها قرار گیرد و دوم سلول های مرده خارج شوند و سوما میزان سلول های تولید شده نسبت به مقدار محیط غذایی تنظیم گردد. از سوسپانسیون های سلولی در تهیه پروتوپلاست ها، باززایی گیاهی از طریق اندام زایی یا جنین زایی در ریز ازدیادی ممکن است استفاده شود. برای بنا نهادن کشت های سوسپانسیون سلولی، کالوس های تمایز نیافته ای که در محیط غذایی القای کالوس نیمه جامد تهیه شده اند را به محیط غذایی مایع انتقال می دهند. کشت ها روی تکان دهنده های چرخشی با سرعت 90-120 دور بر دقیقه در مدت زمان های معینی در تاریکی یا روشنایی و شدت نور معینی قرار داده می شوند. توده های سلولی ریز یا سلول های منفرد معلـق در محیط غذایی مایع را به روش صاف کردن از محلول جدا کرده و همراه با کاغذ صافی روی محیط غـذایی القای جنین کشت می دهند تا این که کالوس های ثانویه توسعه یابند و گیاهان تشکیل شوند.

کشت مرسیتم

شاخه و برگ گیاه از گروهی سلول های کوچک به نام مریستم نوک ساقه منشاء می گیرند. نوک شاخه و مریستم معمولاً در کشت بافت برای تولید گیاه جدید، بیشترین کاربرد را دارند. حدود ۱۰۰ تا ۵۰۰ میکرومتر از نوک مریستم، جهت ایجاد ریز گیاه جـدا مـی شـود. عموماً نوک ساقه ای به طول ۱۰۰ تا ۱۰۰۰ میکرومتر عاری از ویروس هستند. از جوانه های جانبی شامل قسمت کوچکی از ساقه با جوانه جانبی همراه شاخه یا بدون شاخه و برگ می باشد. از مریستم جوانه گل معمولا استفاده تجاری ندارند، اما می توان از این اندام ها ریز گیاه ایجاد کرد. دیگر منابع ایجاد ریز گیاه شامل: پهنک برگ، مریستم بین دو گره، قطعات کوچک ساقه، جنین نـارس برای کشت بافت استفاده دارند.

پس فناوری کشت مریستم عبارت است از کشت مریستم جوانه های انتهایی و محوری شاخه های گیاهان در محیط های غذایی محتوی سیتوکینین زیاد و تولید گیاهان کامل، که برای بسیاری از گیاهان زراعی به ویژه آنهایی که به روش تکثیر رویشی ازدیاد می یابند مورد استفاده قرار می گیرد. این روش برای حذف ویروس به ویژه در سیب زمینی که بیش از ۲۰ نوع ویروس در آن شناسایی شده است کاربرد دارد. مریستم تـوده ای از سلول های در حال تقسیم فعال و تمایز نیافته به قطر 0/1 میلی متر و طول 0/25 میلی متر است که فاقد سازگان آوندی بوده و بنابراین جمعیت ویروسی در آنها پایین است و اغلب این ویروس ها به گیاهان حاصـل انتقـال نمی یابند. گیاه چه هایی که در آزمایشگاه تهیه می شوند از لحاظ ژنتیکی همانند والد خـود هستند و برای تکثیر سریع ذخایر بذری سیب زمینی و عملیات شیمی درمانی و گرما درمـانی کـه بـازدهی حذف ویروسی را بهبـود میبخشند به عنوان مواد اولیه محسوب می گردند. علاوه بر سیب زمینی بسیاری از گیاهانی که آلودگی به ویروس در آنها مشاهده شده است مانند چغندر قند، توت فرنگی، سیب زمینی شیرین، گل کلم، موز و گیاهان دیگری که از طریق رویشی تکثیر می یابند، این روش برای حذف ویروس مناسب است. در حال حاضر فنون کشت مریستم در تکثیر انبوه، حذف عوامل بیماری زا و حفظ ذخایر توارثی مورد استفاده قرار گرفته است.